Trilostan hæmmer selektivt og reversibelt enzymsystemet 3-beta hydroxysteroid isomerase og blokerer dermed for produktionen af kortisol, kortikosteron og aldosteron.
Stoffet reducerer produktionen af glukokortikoide og mineralokortikoide steroider i binyrebarken. Hermed reduceres de cirkulerende koncentrationer af disse steroider.
Trilostan modvirker desuden aktiviteten af det eksogene adrenokortikotrope hormon (ACTH). Stoffet har ingen direkte effekt på centralnervesystemet eller kredsløbet.